Bloco de Genética Molecular do Curso de Genética Básica- 2017

UFRJ- Instituto de Biologia- Departamento de Genética

Prof. Ana Coelho- s. 105, 2. Andar.

Mapeamento por transdução, Ciclo Lítico e Lisogênico de Fagos

Transdução generalizada e mapeamento:
Tem uma pequena parte no final do capítulo 10 sobre isso
Na transdução generalizada, fragmentos de tamanho pequeno, p. exemplo 50kb, de DNA bacteriano são injetados dentro de uma bactéria receptora. Esses fragmentos podem ser incorporados por recombinação, de forma total ou parcial, no genoma bacteriano. Pode ser feita uma medida da frequência com que dois genes próximos são co-transduzidos (ou seja, incorporados em conjunto ao DNA bacteriano).
Quanto mais próximos os genes estiverem, é mais provável que eles sejam incorporados em conjunto ao genoma, e quanto mais afastados, menos provável que sejam co-transduzidos.
Isto permite fazer medidas de distância entre os genes, baseando- se em medidas de co-transdução.

Este tipo de mapeamento feito por transdução geralmente é utilizado para mapear pequenas regiões específicas do genoma, e principalmente para descobrir a ordem exata de tres genes (cruzamento de 3 pontos).
Neste tipo de experiência, os recombinantes para um dos marcadores (dos 3 usados) são selecionados, normalmente por crescimento em meio mínimo com alguns suplementos. Depois as colônias são testadas uma a uma para a presença dos outros marcadores, fazendo-se uma tabela com os números obtidos, que permite concluir qual a ordem destes marcadores.
Os outros marcadores são denominados de marcadores não selecionados.
Note que existe duas razões pelas quais um gene pode ser transduzido mas não os genes vizinhos: em primeiro lugar, um gene pode ser incorporado ao fago e os seus genes vizinhos não. Por outro lado, mesmo que os tres genes tenham sido incorporados no fago, e injetados dentro da bactéria receptora, precisamos de dois eventos de recombinação homóloga para incorporar estes genes ao cromossoma, e pode ser incorporado um sub-conjunto dos genes.

Quando queremos, ao contrário, localizar um gene ao longo de todo o genoma, fazemos um mapeamento por conjugação, utilizando linhagens Hfr.

Bacteriófagos, ciclo lítico e ciclo lisogênico:
No capítulo 10 fala sobre isso

Fagos constituidos por material genético e proteinas. Existem fagos contendo DNA feixe duplo como material genético, outros contendo DNA feixe simples e outros contendo ainda RNA.

Tipos de fago, o que podem fazer com o DNA bacteriano.

Fagos podem ter uma estrutura com uma cabeça e uma cauda e fibras no fim da cauda. Geralmente são icosaedros (20 faces triangulares). Ou ter somente uma cabeça. Ou ser um fago filamentoso, com uma estrutura tubular. Nos fagos que tem uma cabeça o DNA fica no seu interior. No caso de fagos filamentosos, o DNA fica embebido ao longo de todo o fago.

Os fagos não se reproduzem por si mesmo, dependem de uma bactéria hospedeira para isso.

Alguns fagos fazem somente o ciclo lítico, sendo chamados também de fagos virulentos. Outros fagos fazem o ciclo lítico e outro ciclo denominado de lisogênico, são fagos denominados de temperados.

Ciclo lítico básico: Ligação do fago à bactéria, entrada do DNA na célula, replicação do DNA ao mesmo tempo em que ocorre transcrição de mRNA e tradução de proteinas. Geralmente transcrição começa até antes de replicação de DNA.

Programação muito importante: tem alguns genes expressos logo no início (early genes)

outros expressos mais adiante no ciclo. Por exemplo, se produtos que ajudam a lisar a célula fossem produzidos no início, célula lisaria antes de produzir novos fagos.

Alëm disso, no caso de muitos fagos (mas não todos), a síntese de RNA bacteriano ou a duplicação de DNA bacteriano é inibida, dando uma vantagem para o fago. Muitas proteinas bacterianas são utilizadas na replicação dos fagos. Geralmente são produzidos de 50 a 1000 partículas de fago por célula bacteriana.

No caso de fagos icosaédricos, normalmente a cabeça é feita separadamente da cauda, e o DNA entra no fago antes da ligação a esta cauda, que fecha o fago.

Na maioria dos fagos é sintetizada na célula uma lisozima ou uma endolisina que causa o rompimento da parede celular. Mas nem todos os fagos virulentos causam lise da célula. Alguns fagos filamentosos liberam continuamente fagos através da parede celular, num processo de brotamento. Essas células podem produzir fagos por períodos prolongados.

Existem milhares de fagos distintos já isolados. Os hospedeiros de cada fago são específicos, e normalmente limitados a uma ou poucas espécies, ou algumas linhagens de uma espécie. Espectro de hospedeiros (host range) é o conjunto de bactérias que podem ser infectadas por um determinado fago.

Série de fagos isolada por Demerec em 1940. Fagos T, que infectam linhagem B de E. coli., com DNA feixe duplo. Fagos T-par (T2, T4 e T6) contem hidroximetil citosina ao invés de citosina como base nitrogenada (pareia com G). Alem disso tem glicosilação, açucar ligado à hidroximetilcitosina.

T4 tem terminais redundantes, ou seja repetição de um trecho no final.

Além disso tem permutações cíclicas, ou seja começo do empacotamento em cada fago é diferente do outro, dando origem a uma população de fagos distintos um do outro, mas originados no mesmo fago.

Muito importante: genes com funções relacionadas muitas vezes estão localizados juntos no DNA do fago, e muitas vezes são transcritos juntos.

Método de encapsulamento: preenchimanto do capsídio. DNA vai entrando até um certo tamanho capaz de preencher o capsídio. Cabe na cabeça um tamanho de DNA um pouco maior do que uma cópia do genoma, assim sempre tem um pequeno padaço repetido na ponta.

Lisogenia: alguns fagos tem também, além do ciclo lítico, a possibilidade de se incorporar ao cromossoma bacteriano. Nessa situação são chamados de profagos e se replicam junto com o cromossoma bacteriano. Desta forma seu número na célula não aumenta, se mantendo em um por genoma. Ele pode se manter desta forma por muitas gerações, e temos linhagens estáveis lisogênicas para algum fago.

O exemplo típico de fago lisogênico é o fago l (lambda) .

Posteriormente, a qualquer momento, pode haver a ativação do fago, que sai do cromossoma bacteriano e faz um ciclo lítico. Na situação de lisogenia normalmente existe um repressor sintetizado, que mantem os outro genes do fago sem ser expressos. Em algum momento este repressor pode se retirar e uma bactéria entra em ciclo lítico. Se isso acontece em poucas células da cultura não é notado. Por outro lado pode haver uma indução coletiva de toda a cultura, por exemplo após indução com UV 260nm. Obs. Sempre existe, numa cultura de células lisogênicas, um bom número de fagos livres no meio de cultura. Estes foram liberados por algumas poucas bactérias que entraram espontâneamente em ciclo lítico.