Bloco de Genética Molecular do Curso de Genética Básica- 2017
UFRJ- Instituto de Biologia- Departamento de Genética
Prof. Ana Coelho- s. 105, 2. Andar.
Tecnologia do DNA recombinante.
DNA recombinante: novas combinações artificiais criadas entre fragmentos de DNA de um organismo em estudo e algum vetor, que vai servir para transportar e replicar este DNA.
Isolamento de DNA do organismo de interesse, e DNA do vetor. Processo básico: corte com enzimas de restrição, do DNA de interesse e do vetor. Ligação entre os fragmentos, com o uso de ligase. Introdução de moléculas individuais da mistura de ligação em bactérias, p. ex. Obs: A introdução em bactérias é uma etapa de separação dos vários produtos formados na ligação.
Enzimas de restrição. Sítios de reconhecimento, forma de cortar.
Vetores de clonagem usuais: plasmídios, fagos, cosmídios. Capacidade de clonagem diferente para cada um deles. Plasmídios <20kb, fagos ~15kb, cosmídios, ~45kb.
Mais recentemente foram desenvolvidos vetores de grande capacidade de clonagem: YACs, que são cromossomas artificiais de levedura, podem conter até 1000kb e BACs, que são plasmídios bacterianos capazes de clonar da ordem de 100kb. São muito úteis para projetos de sequenciamento de grandes fragmentos com vem acontecendo agora com o sequenciamento do genoma humano, ou de genomas bacterianos.
Preparação de uma biblioteca genômica: clonagem de muitos fragmentos, de tal forma que tenha representantes de todas as regiões do genoma. Pode ser feita uma bibliotec genômica, ou uma biblioteca de cDNA. Neste último caso só vão estar representadas as partes transcritas do genoma. Neste caso também não vai haver introns, pois os mRNAs usados como material inicial já não tem esses introns.
Como encotrar depois clones específicos utilizando sondas? Hibridização entre DNA é usada para isso no caso de DNAs. Pode já ter o mesmo gene proveniente de outro organismo por exemplo. Ainda pode ter homologia o suficiente para hibridizar com o gene do organismo em estudo. DNA da sonda (desnaturado) pareado com DNA da coleção de clones (também em feixe simples). Pode encontrar um clone no meio de milhares de colônias ou placas de lise. Pode também utilizar uma sonda que não seja exatamente do gene que esteja procurando, mas seja um gene que fica próximo no genoma, e assim pode achar um clone que tenha o gene de interesse e esse outro que fica próximo e esteja clonado no mesmo fragmento ("caminhando" no cromossoma).
Método de obtenção de cDNA, com transcriptase reversa.
Pode ter também a sequência de um trecho da proteina, e planejar a sequência de um pequeno DNA a partir da proteina. Este pequeno DNA é suficiente para se hibridizar com o clone desejado, da mesma forma que outras sondas vinda de fragmentos de DNA clonados.
Na construcão da biblioteca, pode separar inicialmente uma parte do genoma para simplificar o processo: por exemplo, pode separar um único cromossoma, ou um fragmento de restrição de deeterminado tamanho.
Bibliotecas de expressão: Pode também querer detetar na biblioteca a expressão de algum produto, uma proteina. Para isso normalmente vai usar um anticorpo contra esta proteina, e depois algum método colorimétrico ou radioativo para detetar a presença do anticorpo ligado.
Construção de mapas de restrição. Utilização de várias enzimas, isoladamente ou juntas em pares, localizando assim pontos fixos no DNA. Vai definir um mapa físico do DNA, que geralmente vai ser comparado com um mapa genético.