Quinta aula:

O código genético, tRNAs e ribossomas.

mRNA sendo traduzido em proteinas, compostas dos 20 aminoácidos.

- O código em tripletes:

Algum código ou combinação de bases indicando a presença de um aminoácido específico.

Código superposto ou não? 1961 experiencias mostrando que não havia superposição: mudanças de uma base mudavam apenas um aminoácido. Experiencias com acido nitroso causando mutacoes em virus do mosaico do tabaco.

Necessidade de codificar pelo menos 20 aminoácidos distintos. Com tres nucleotídeos poderia ter 4³ =64 informações diferentes, suficientes para os 20 aminoácidos. Assim, esperava-se um código genético de 3 ou mais letras.

Experiência de Crick, Brenner e outros, 1961, mostrando que código genetico é de 3 letras e não mais.

Utilizaram fago T4 e mutações rII. Este tipo de mutantes apresenta uma placa de lise com morfologia diferente do normal, placas maiores do que a do tipo selvagem. Utilizaram proflavina para induzir mutações. É um tipo especial de mutações, na qual um par de nucleotídeos é adicionado ou retirado do DNA.

Depois usaram um desses mutantes de proflavina e buscaram revertantes do mesmo, detetados por placas do tipo selvagem em linhagens de E.coli K.

A análise genética desses revertantes mostrou que as modificações não haviam ocorrido no mesmo local que a modificação original. Eles tinham, ao invés disso, uma segunda mutação em outro local do mesmo gen, que compensava a primeira.

Quando isto acontece, o gene tem agora duas mutações, que podem ser separadas por recombinação.

Mutações separadas por recombinação e segundas mutações sozinhas também davam origem a mutantes do tipo rII. Interpretação. Tradução começando de um ponto e depois lendo em série de letras correspondentes aos aminoácidos. Após uma inserção por exemplo todos os aminoácidos ficariam trocados.

Se tivermos uma inserção de nucleotídeo seguida pouco depois por uma deleção de nucleotídeo, o quadro de leitura retornará ao original, ficando só um pedaco de leitura errada entre eles.

Se for definida que a primeira mutação é +, então a segunda mutação, para compensar a primeira, deve ser - (o mesmo raciocínio vale se primeira mutação for -, segunda +)

As experiencias de Crick mostraram que duas mutações + juntas não funcionam, mas tres + (ou tres -) juntas podem funcionar. Esse foi o dado experimental mais importante levando à conclusão de que o código genético é lido através de 3 nucleotídeos de cada vez.

Depois foram repetidas estas experiências com proflavina em um gene cujo produto, a proteina, pudesse ser analisado. Isto foi feito com o gene da lisozima.

Quando analisou sequencia da proteina de um duplo mutante + - obteve a sequência de AA do tipo selvagem, mas com um trecho modificado, localizado entre as duas mutações. A interpretação da experiência anterior estava correta.

O codigo é degenerado: Mais de um código para um mesmo aminoácido.

Existem 64 codons, para 20 aminoacidos. A maioria dos codons deve ter significado pois: na experiencia de Crick, se saisse do quadro de leitura e formasse codons sem sentido ia terminar proteinas, e a reversão ao tipo selvagem não iria acontecer. Se a maioria de codons tem um significado, ocorre troca de aminoácidos, e existe a possibilidade de reversão.

- Decifrando o código genético:

Síntese de RNA in vitro, sem a presenca de DNA, com polinucleotídeo fosforilase. Síntese de RNAs com um único nucleotídeo. O primeiro destes foi poli-U. A partir dele conseguiu-se fazer pela primeira vez (Nirenberg) in vitro uma proteina. A sequencia desta proteina era poli fenil-alanina, ou seja, o triplete UUU codificava fenil-alanina.

Seguindo o mesmo raciocinio foi-se sintetizando RNA com proporções conhecidas de nucleotídeos, e começando a decifrar o código. P. ex. proporção U:G de 3:1. Calcula proporções de vários tripletes, e proporções dos aminoácidos nas proteinas obtidas.

- Papel do tRNA no reconhecimento dos codons.

Utilizando adaptadores, que são os tRNAs para o reconhecimento dos codons.

Experiência importante: tinha tRNA-Cys carregado com AA cisteina. Mudou quimicamente o AA cisteina para alanina, sem modificar tRNA. Utilizou este tRNA na sintese de proteinas e verificou que entrava o AA alanina nas posições onde devia entrar cisteina! Isso quer dizer que o tRNA é que está fazendo o reconhecimento dos codons, e não o AA por si mesmo.

Estrutura do tRNA:

Quatro regioes pareadas

Uma das alças corresponde ao anti-codon, que vai reconhecer o codon do mRNA. Note-se: de forma anti-paralela!

O outro extremo é o sítio de ligação do aminoácido, na ponta 3' OH. Término CCA.

Outras 2 alças denominadas Ty C e DHU.

Existem várias bases modificadas nos tRNAs. As modificações ocorrem após a transcrição do mesmo. Y pseudo-uridina, D: di-hidrouridina

Estrutura espacial em L, com o anticodon numa ponta e o aminoácido na outra.

Cada tRNA levemente diferente dos outros para poder ser reconhecidos por enzimas diferentes, as sintetases (aminoacil tRNA sintetases), que vão fazer a ligação de cada aminoácido a seu tRNA correspondente.

Obs: genes que codificam para tRNA e rRNA não tem produto proteico, o produto é o próprio RNA.

- Continuando a decifrar o código:

Pequenos RNAs de 3 nucleotídeos, não são suficientes para traduzir polipeptídeo, mas suficientes para a ligação do tRNA. Pode saber qual tRNA se liga a cada codon.

Para confirmar código foram feitas experiências por Khorana (prêmio Nobel por isso), com polinucleotídeos repetitivos.

Vários codons para um mesmo aminoácido: aminoácidos podem ter um número de codons correspondentes a eles que varia de um codon, p. ex. no caso do triptofano, até 6 codons, p. ex serina.

Existem duas razoes para isso acontecer:

• Em alguns casos, diferentes tRNAs são carregados com o mesmo AA
• Em outros casos diferentes codons no mRNA são reconhecidos pelo mesmo tRNA carregado com um aminoácido. A terceira base no anticodon não tem a posição muito fixada, existe uma certa flutuação na posição, o que leva ao reconhecimento de mais de uma base no codon, e o mesmo tRNA pode se ligar a mais de um codon.

Outro ponto da tabela de codons; alguns codons não codificam aminoácidos: códigos de parada. 3 codigos de parada. UAG foi deduzido a partir de 6 mutantes do fago T4 (gene da cabeça). Exp. Brenner. UAG amber, UGA opal, UAA ochre. Também são chamados de codons sem sentido.

- Síntese proteica: Descrição sumária e Iniciação:

Processo necessita ainda de mRNA, tRNAs, aminoácidos, fonte de energia, ribossomas, fatores proteicos, enzimas e alguns ions.

Ribossomas consistem de duas subunidades que são designados por sua velocidade de sedimentação

Em procariotos: partículas de 50S e 30S, formando particula de 70S

Eucariotos: 60S e 40S formando 80S.

Quando não estão traduzindo proteinas, os ribossomas estão normalmente dissociados em suas sub-unidades na célula.

Durante a síntese as subunidades se juntam e no final da tradução se dissociam novamente.

Posicionamento dos rRNAs e proteinas na composição das subunidades ribossômicas.

Sítios P e A, de posicionamento do peptídeo em formação e do novo AA-tRNA que vai se juntar ao polipeptídeo já formado. Estes dois sítios constituidos de parte da subunidade 50S e parte da 30S. Além destes sítio E, de ligação do tRNA que está saindo (este sítio na subunidade 50S).

Iniciação da tradução:

Junção de mRNA, subunidade 30S do ribossoma e tRNA-Met. Complexo de iniciação. Isto formado sobre sítios de ligação do ribossoma no mRNA. Usa GTP e então liga subunidade maior 50S do ribossoma.

Obs: em procariotos geralmente o primeiro aminoacido inserido é formil metionina ao invés puramente de metionina. Existe um tRNA específico para o início, um dos dois tRNAs para metionina (ambos tem o mesmo anticodon). O radical formil é adicionado após a ligação da metionina com o tRNA, e este radical bloqueia o grupo amino. No entanto as proteinas bacterianas não apresentam o radical formil no seu início. Existe enzima deformilase que retira este formil. Existe ainda enzima aminopeptidase, que algumas vezes retira também a metionina da primeira posição. Sendo assim, muitas proteinas começam com metionina, mas não todas.

Iniciação diferente em eucariotos: tRNA próprio para iniciação, mas Met não formilada. Ligação inicial do tRNA à subunidade 40S, sem presença de mRNA. Entrada deste complexo por extremidade 5', para buscar triplete de início.