UFRJ- Instituto de Biologia- Departamento de Genética
Bloco de Genética Molecular do Curso de Genética Básica- 2017
Prof. Ana Coelho- s. 105, 2. Andar.
Segunda aula: Replicação do DNAProcesso básico fundamental para a multiplicação celular, e é parte integrante de outros processos tais como reparo, recombinação e transposição.
Replicação Semi-conservativa.
Poderia ser de outros modos a princípio, conservativa, semi-conservativa ou dispersiva
Como diferenciar estes modos de replicação?
Experiência de Meselson- Stahl:
E coli cultivada em meio contendo isótopo pesado 15 N.
Depois remove células deste meio e as coloca para continuar síntese de DNA em 14N, deixando por tempos variados (uma ou duas divisões celulares).
Técnica de centrifugação em gradiente de cloreto de césio (CsCl), equilíbrio por densidade. Ultracentrífuga. 50000rpm muitas horas.
Isótopo pesado muda a densidade do DNA
Após um ciclo de multiplicação: Banda de densidade intermediária.
Duas gerações: Uma banda intermediária, uma banda leve.
Se começa com DNA feixe duplo marcado, esse resultado só está de acordo com a hipótese semi-conservativa.
Como se apresenta o DNA total de um organismo?
Pode ser um DNA feixe duplo circular, como por exemplo no caso de E. coli
Pode ser também com feixes duplos lineares, como no caso dos cromossomas de eucariotos ou no caso de alguns bacteriófagos. Obs. Além do DNA os cromossomas contem ainda proteinas. Cada cromátide uma única molécula de DNA.
Para a replicação deve haver forquilhas de replicação formadas. Como visualizá-las: Experiencia de Cairns, incorporando trítio ao DNA.Visualização: formas teta, DNA circular marcado radioativamente. No máximo duas forquilhas de replicação
Replicação unidirecional versus replicação bidirecional.
Geralmente a replicacao é bidirecional, havendo casos de replicacao unidirectional. Um dos métodos para determinar se é uni ou bidirecional: através de marcação radioativa, dando pulso forte num período curto. Vai ver uma forquilha ou duas, indo nas duas direções.
Problema geométrico da separação das fitas de DNA. Enzimas topoisomerases.
Origem de replicação e iniciação.
Em E. coli, DNA circular e início de replicação é único.
Velocidade de replicação lenta em eucariotos: muitas origens de replicação.
Regras básicas da sintese de DNA:
- Os components devem estar presentes: os quatro nucleotídeos 5' trifosfatos.
- Deve haver um molde para ser copiado (uma fita de DNA pré-existente)
-É necessário um iniciador para a síntese de DNA. Pequeno feixe de ácido nucleico que e estendido por DNA polimerase. Durante síntese in vivo, iniciador é de RNA.
- Enzimas envolvidas em síntese de DNA: DNA polimerases.
A síntese feita pela DNA polimerase é sempre feita na direção 5'- 3' .
Problema da orientação: Forquilha indo numa direção, mas sintese só pode ser 5'-3': síntese de um feixe é continua, mas do outro feixe é em pequenos pedaços, fazendo 5'-3': fragmentos de Okazaki.
DNA polimerase principal em bactérias: DNA pol III, fazendo a síntese dos feixes de DNA
DNA pol I: síntese de reparo de DNA, e retirada de iniciadores de RNA que foram utilizados na síntese do feixe atrasado.
RNA polimerases podem comecar síntese de novo, sem precursor
Iniciadores são bem pequenos, da ordem de 5 nucleotídeos.
Após iniciador DNA polimerase continua a síntese
Para finalizar síntese de DNA, fragmentos devem se juntar e RNA deve ser substituido por DNA: substituição de RNA feito por DNA pol I: ligação feita por DNA ligase.
Atividades exonucleolitica 5'-3' da DNA polimerase I
Se nucleotídeo errado incorporado, há correção do erro, atividade exonucleolílica 3'-5' de DNA pol III e DNA pol I.
Nucleotídeo errado é retirado, e novo nucleotídeo é incorporado.