CURSO DE GENÉTICA DE MICRORGANISMOS- 2017 - Prof. Ana Coelho

Regulação da expressão gênica e fago lambda.

As células fazem regulação da expressão gênica por muitas razões: por economia de energia, não fazendo produtos desnecessários em determinadas fases de crescimento. Ou não produzindo proteinas usadas em processos específicos tais como a esporulação.
Em bactérias temos regulação a nível de transcrição e tradução, e alguns outros exemplos de regulação pós-transcricional. No entanto a grande maioriados casos é de regulação a nível de início datranscrição.
Os operons: muitos dos genes bacterianos fazem parte de operons. Nestes casos temos uma região regulatória única afetando a expressão de muitos genes. Em muitos casos estes operons contem genes participantes deuma mesma via metabólica da célula, e nestes casos a ativação ou repressão do operon, corresponde à expressão ou não de todo um caminho bioquímico da mesma.
Regulação positiva: uma proteina celular vai ativar a expressão de determinado gene ou operon.
Regulação negativa: uma proteina vai reduzir a expressão de determinados genes.
Note-se que um mesmo gene pode ser ativado positivamente por uma proteina e regulado negativamente por outra.
Efetores: Pequenas moléculas que se ligam às proteinas reguladoras, fazendo comque elas estejam ativas ou não em determinados momentos.
Ativadores fazendo regulação positiva e repressores fazendo regulação negativa normalmente se ligam ao DNA. Muitas destas proteinas contem uma região com a estrutura hélice- dobra- hélice, de forma a permitir uma interação com o DNA.
A segunda hélice desta estrutura "entra" na estria maior do DNA, fazendo uma boa interação.

Níveis de regulação da transcrição:
Exemplo clássico de regulação gênica: operon lac (não será vista aqui a parte básica, pois foi em Genética Básica).
Atualização da regulação do operon lac
O modelo do operon lac de Jacob e Monod, sobrevivendo até hoje. Verificou-se no entanto que existe mais de um sítio operador. Na verdade são 3 sítios operadores, o1, o2 e o3, sendo que o o1 é o que era conhecido há mais tempo, e se sobrepõe ao sítio +1, de início de transcrição.
O sítio o3 fica a -82 e o sítio o2 fica a +401.
Supõe-se que o repressor Lac, tetramérico, se ligue a dois destes operadores ao mesmo tempo, fazendo uma curva no DNA. Esta curva dificultaria ainda mais a ligação da RNA polimerase.

Regulação catabólica ou repressão catabólica:
Este fenômeno se refere ao fato de que, na presença de glicose, não ocorre a utilização pela célula de uma variedade de açucares.
No entanto, quando a glicose se esgota do meio de cultura, os operons responsáveis pelo metabolismo destes açucares começam a se expressar.
A expressão do operon lac, por exemplo, é induzida ao se esgotar a glicose do meio. A proteina CAP é responsável por esta ativação, em conjunto com o cAMP (AMP cíclico).
Na presença de glicose os níveis celulares de cAMP ficam muito baixos, e a proteina CAP não se liga a seu sítio logo acima do operon lac. Na ausência de glicose os níveis de cAMP aumentam, este interage com CAP, e ocorre a ligação ao DNA em locais adequados.

Regulação do operon gal:
O operon gal está envolvido na utilização do açucar galactose.
Ele apresenta 3 genes principais galE, galT e galK. Além destes existe o gene galR, que corresponde a um repressor do operon, e ainda um gene galU, localizados em outras partes do cromossoma.
A galactose não serve somente como fonte de carbono e energia para a célula. Alguns dos produtos de sua degradação, como a UDPgalactose são utilizados na síntese de polisacarídeos constituintes do LPS.
Existem dois promotores e dois operadores no operon gal.
Um dos operadores é acima dos promotores e o outro abaixo, e já interno ao gene galE.
Os operadores atuam em conjunto, ligados a duas moléculas do repressor.
Um dos promotores do operon gal é regulado por repressão catabólica, sendo estimulado por CAP + cAMP, na ausência de glicose.

Operon triptofano: este é um operon responsável pela síntese do aminoácido triptofano na célula.
Este operon foi intensamente estudado, e são conhecidos diversos mecanismos de regulação do mesmo.
O operon é constituido por 5 genes, trpE, trpD, trpC, trpB e trpA. Existe ainda um gene do repressor trpR, localizado em outra região do cromossoma.
Este operon é regulado negativamente pelo repressor TrpR.
No entanto aqui a situação normal é de síntese dos produtos gênicos. Só na presença de um excesso de triptofano é que ocorre a interação entre o trptofano e o repressor. O repressor ligado ao triptofano tem uma conformação diferente, e se liga ao operador do operon, reprimindo-o.
Atenuação:
A atenuação é uma forma de regulação de término de transcrição.
Este mecanismo foi descrito inicialmente para o operon triptofano (trp) e posteriormente encontrado em outros operons, tais como o his.
Basicamente, existe uma escolha entre fazer um transcrito longo, com todos os genes usuais do operon, ou fazer um término precoce do transcrito, em situações nas quais os produtos deste operon já estão presentes na célula.
O operon triptofano já tem uma regulação por um repressor.
No entanto existe esta segunda forma de regulação superimposta à feita pelo repressor. Mutantes trpR, do repressor de trp, ainda sintetizam mais das enzimas do operon triptofano na ausência deste aminoácido.
Verificou-se que a regulação não era pela quantidade livre do aminoácido e sim pelo tRNA carregado, ou seja o tRNA Trp. Se existe tRNA carregado, é porque existe abundância de Trp.
A região afetada pela regulação não é o promotor, e sim uma região abaixo de uma região líder, trpL, mas antes do primeiro gene do operon, trpE.
Um excesso de tRNA Trp faz a transcrição terminar logo após a região líder.
A região lider contem 4 trechos de DNA (regiões 1 a 4), que podem formar estruturas secundárias, por pareamento entre 1e 2, 2 e 3 ou 3 e 4. Nem todas estas podem acontecer ao mesmo tempo. Quando 2 e 3 se pareiam, elas não podem ao mesmo tempo formar os pares 1/2 e 3/4.
Em particular quando 3 e 4 se pareiam, isto é reconhecido como um sinal de término de transcrição independente de rho.
Assim, o RNA da região líder pode estar numa forma que indica término de transcrição (se 3 e 4 se parearem), ou em outra estrutura secundária que não indique término (se 2 e 3 se parearem). Nesta última forma a transcrição vai em frente, incluindo o resto do operon trp.
A região 1 contem dois codons para o aminoácido Trp. Assim, durante a tradução da região lider, se houver falta de triptofano, o ribossoma faz uma pausa neste ponto, esperando um tRNA Trp
. O posicionamento do ribossoma sobre a região 1 fazcom que ela não se ligue à região 2, que fica livre para se ligar a 3.
Nesta situação (falta de Trp), forma-se o par 2/3, e a transcrição vai em frente.
Na presença de Trp, a traducao vai mais à frente, até parte da região 2, que não fica disponível para pareamento com 3. Assim a região 3 se pareia com 4, indicando término de transcrição.

Antiterminação:
Mecanismo no qual uma terminação deixa de ocorrer e o transcrito continua a ser feito, incluindo mais genes.
NusA: proteina antiterminadora, age prolongando pausas em alguns locais onde ja acontece pausa naturalmente. Tem um efeito inibitório na elongação.
A proteina NusA se liga à proteina central da RNA pol, livre ou no complexo ternário, mas não à proteina completa, indicando que se liga na mesma região que o fator sigma.
NusA tem 2 efeitos: dificulta a ligação dos NTPs e aumenta a duração de algumas pausas.
Como aumenta estas pausas? É uma subclasse de sequências, não qualquer ponto do RNA. É dependente da sequência. Em todos os casos o RNA feito tem potencial de formação de haste e alça (mas o reverso não é verdadeiro, nem sempre que forma haste-alca é afetado por NusA).
Possível papel. Retardar a transcrição um pouco, para que funcione bem o acoplamento transcrição- tradução. Não ficam grandes trechos de RNA livres sem tradução.
NusA, junto com outras proteinas bacterianas, serve como antiterminador no caso do gene N do bacteriófago lambda.

Existem outros mecanismos de regulação da expressão gênica, tais como a regulação da tradução.
E caminhos biosintéticos podem ser regulados também de outras formas, tais como a inibição de uma das proteinas iniciais da via pelo produto final.
Novamente o operon trp oferece o exemplo mais característico de inibição pelo produto final. No caso o aminoácido triptofano inibe a antranilato sintetase, a primeira enzima da via de síntese do triptofona.

Artigo: H-NS: a modulator of environmentally regulated gene expression (1997) Atlung, T & H Ingmer. Molecular Microbiology 24(1): 7-17 H-NS é uma ds proteinas presentes em grande quantidade e associada ao DNA de Escherichia coli. Ela se liga em particular a DNA que tem uma certa curvatura causada pela sequência mesmo (sequencias ricas em A/T fazem isto).
Além de se ligar ao DNA ela consegue condensá-lo, como ocorre no caso das histonas. Daí seu nome: histone-like nucleoid structuring protein. No entanto a sua sequência não tem homologia com a sequência das histonas.
É uma proteina de 137 aa, 15,4kDa.
Mutantes no gene hns são pleiotrópicos (vários fenótipos distintos): crescimento mais lento, maior osmosensibilidade, etc.
Foi mostrado que H-NS afeta negativamente a transcrição de muitos genes não relacionados, é um tipo de regulador global.
Mais de 30 proteinas tem a quantidade diminuida na presença de H-NS.
Aparentemente existe um outro grupo de proteinas que é induzida pela presença de H-NS, mas como estas não estão ainda estudadas, pensa-se normalmente em H-NS como um regulador negativo.

. Muitos dos genes afetados por H-NS são regulados por fatores ambientais tais como osmolaridade, temperatura, anaerobiose, pH ou fase de crescimanto.
Vários destes genes são também regulados por outras proteinas regulatórias.
Geralmente o efeito de H-NS é mais forte nas condições não induzidas nestes casos.
Geralmente a repressao é da ordem de 2 a 20x a expressão usual.
Um exemplo de repressão mais intensa, da ordem de 100 vezes, ocorre em Shigella, com alguns genes de virulência. Neste caso H-NS atua em pelo menos dois pontos de uma cadeia de genes regulatórios. Desta forma a própria produção dos ativadores, VirF e Vir B, é inibida.

Estrutura de H-NS: C terminal faz ligação DNA, e N terminal faz dimerização.
Provavelmente interage com o DNA na forma de dímero.
Existem 3 diferentes formas de H-NS, com carga total distinta. As 3 se ligam ao DNA, e não se sabe o papel destas diferentes formas na regulação.

Ligação ao DNA.
Se liga a todo o tipo de DNA, preferindo DNA feixe duplo, e DNA curvado.
Existem 2 tipos de ligação feitos por H-NS: uma ligação específica, para os reguladores onde atua, e outra, uma ligação inespecífica em todo o DNA.
Aparentemente H-NS adota conformações diferentes nos dois tipos de interação com o DNA.
A concentração de H-NS necessária para uma ligação inespecífica é só 3 a 6 x maior do que a necessária para as interações específicas.
Foi feito um cáluculo de que a quantidade de H-NS presente na célula seria suficiente apenas para as ligações específicas.

Regulação da expressão de hns:
Gene hns é autoregulado, diminui sua própria transcrição.
Algum aumento na quantidade de H-NS na fase estacionária.
Afirma no entanto que que gene hns não é induzido na passagem para fase estacionária.

Choque de frio: hns é induzido por choque de frio (passagem de 37C para 10C). Proteina CspA, feita no frio, ativa expressão de hns.
Quantidade de H-NS presente nas células no frio é de 3 a 4 x maior do que a 37C.

Proposta de mecanismo de regulação por H-NS: "silenciamento" do DNA (ou seja toda uma região não seria transcrita) na região de ligação de H-NS. Mas outros genes colocados na suposta região de silenciamento foram expressos.

Alvo importante de H-NS: rpoS, gene responsável pela síntese de sigma S (sigma 38). Mutantes hns com 10 x + sigma S. É possível que o efeito de H-NS em alguns casos seja um efeito indireto, devido à diminuição de sigma S.
Efeito na expressão de rpoS é pós transcricional: efeito na eficiência de tradução e estabilidade da proteina.

Existe uma proteina homóloga a H-NS em E. coli, a proteina StpA.
A homologia é de 57% de aa.
StpA pode substituir H-NS na regulação de alguns genes, mas não todos regulados por H-NS.
Fago lambda

Fago lambda é um fago temperado, com ciclo lítico e lisogênico. É o exemplo clássico de fago temperado, sendo o protótipo dos mesmos.
O ciclo lítico toma aproximadamente 45 minutos, produzindo da ordem de 100 fagos por célula.
Note que, como outros fagos temperados, a maioria das infeccoes com fago lambda resultam em ciclo litico e lise, com uma pequena fracao (<5%) indo para a lisogenia.
Existem outros fagos relacionados, da mesma familia de fagos lambdóides: phi80, 21, 434.
O seu DNA feixe duplo tem 48,5kb. Ele tem terminações em feixe simples, de 12bp, e que são complementares entre si.
Infecção:
Interação do fago com receptores de membrana codificados por lamB. Esses receptores normalmente usados para absorção de maltose.
Ao entrar na bactéria este DNA está linear, mas pareia as pontas complementares, tomando uma forma circular.
É feito o fechamento covalente pela DNA ligase e enrolamento pela girase.

O fago lambda tem aproximadamente 40 genes. Genes para funções relacionadas estão em grupos.
Estes grupos correspondem a genes de:
Programação da expressão gênica é particularmente importante com bacteriofagos.
Existem genes iniciais, intermediários, e tardios, conforme o período do ciclo em que são expressos.

Replicação:
Dividida em duas fases, inicial e tardia, com mecanismos diferentes.
Inicial, replicação de círculo fechado, em forma teta.
Tardia: formação de moléculas concateméricas, pelo mecanismos de círculo rolante.
Replicação inicial é bidirecional, começa perto do gene O, e os genes envolvidos com a replicação estão todos aí perto.
Para começar precisa dos produtos dos genes O e P, do fago, proteinas da hospedeira (RNApol, dnaB, primase, DNApolIII). Precisa ainda do produto do gene N, de forma indireta, pois sem este não faz O e P.
Esta primeira fase se estende de 5 a 15 minutos após a infecção. Depois começa a fase tardia.
Fase tardia, em círculo rolante, feixe 5' vai se soltando do círculo, vai havendo síntese na ponta 3', e formação do feixe complementar ao que se solta do círculo, feito aos pedaços.
A proteina gam, do fago, é necessária para esta transição, pois aparentemente inativa RecBC, que cortaria o lambda no início da fase de círculo rolante.
Maturação: O fago lambda é encapsulado a partir de moléculas concateméricas contendo várias cópias do mesmo. Utiliza dois sítios de terminação coesivas (cos) para reconhecer e cortar as extremidades de lambda. Genoma do fago só tem uma cópia do sítio cos, assim, uma cópia única de lambda não é substrato para encapsulamento.

Ciclo do fago:
Quando o DNA de lambda entra numa célula o ciclo começa sempre do mesmo modo, produzindo proteinas cro e N, genes iniciais.
Eles são expressos a partir dos promotores pR (direita) e pL(esquerda) respectivamente. Estes são promotores divergentes, que flanqueiam o gene cI do repressor.
A proteina N vai atuar como antiterminadora nos términos tR e tL, que terminavam os mRNAs de cro e N, fazendo com que estes mRNAs agora sejam mais longos.
cro tem duas funções: impede síntese do repressor, ver adiante e impede síntese dos genes iniciais, mais adiante no ciclo (ver adiante).
Com a antiterminação, o lambda entrou na fase de expressão de genes intermediários do ciclo, que incluem os genes cII e cIII (ver adiante), os genes O e P, necessários para a sua replicação, o gene Q, e outros genes de recombinação.
Até aqui o lambda se comporta igual, quer vá fazer um ciclo lítico ou lisogenia, ou seja os genes intermediários ainda são feitos nos dois ciclos. Depois escolhe se vai expressar genes tardios (indo para ciclo litico) ou estabelecer repressao e lisogenia.

A proteina Q tambem age como antiterminadora, mas em relação aos genes tardios.
Ela atua logo apos o promotor dos genes tardios, se ligando à RNA polimerase.
Se a proteina Q se acumular numa certa concentração, os genes tardios são feitos, e já houve definição de que esta havendo um ciclo lítico.

O produto do gene cII é um ativador de transcrição a partir de um outro promotor, chamado pRE (repression establishment, ou estabelecimento de repressão), e virado para a esquerda, que começa a transcrever o gene cI, do repressor. A proteina cII é auxiliada indiretamente pelo produto de cIII. Assim, cII e cIII levam ao começo da produção do repressor cI.
Note que o transcrito iniciando de pRE é superposto ao gene cro, mas ele não contem a informação para o produto cro, que é feito a partir do transcrito que vai para a direita a partir de pR.

A manutenção da lisogenia requer uma síntese aumentada do repressor cI, a partir de outro promotor, pRM, que fica bem próximo a pR, mas faz transcrição para a direção oposta, ou seja para a esquerda.
Assim, existe uma região intergênica importante, entre o promotor pRM e o promotor pR.
Nesta região existem 3 sítios operadores, oR1, oR2 e oR3 (da direita para a esquerda), que tem afinidade por duas proteinas, cro e o próprio repressor cI.
Estas duas proteinas vão competir pela ligação destes sítios.
Estes sítios se sobrepõe aos promotores, sendo que oR1 e oR2 se superpõe a pR e oR3 se sobrepo~e a pRM.
A afinidade das duas é distinta: cro tem afinidade maior por oR3, e cI tem maior afinidade por oR1.
A ligação de cro a oR3 impede a transcrição do repressor a partir de pRM. Por outro lado deixa livre o promotor pR, fazendo os produtos intermediários e tardios.
Mais adiante no ciclo litico a proteina cro ocupa os outros sítios, e acaba bloqueando até a sintese dos produtos iniciais. Mas quando isto ocorre já existe uma boa quantidade de proteina Q na célula, e o ciclo lítico vai em frente.
Por outro lado a ligação de cI ao sítio oR1, auxilia a ligação de mais cI ao oR2 (ligação cooperativa). O promotor pRM fica aberto neste caso e o promotor pR fica bloqueado. cI ainda auxilia a ligação da RNA polimerase ao promotor pRM.
Nesta situação o cI é sintetizado, e o promotor dos genes intermediários ficou bloqueado, e ocorre a lisogenia.
Note-se que a proteina cI age como um estimulador da síntese de mais cI, ao se ligar a oR! e oR2, mas também age como um repressor da síntese a partir de pR e pL.
Na situação de lisogenia o único gene expresso a partir de lambda é cI, a partir de pRM.

A indução do ciclo lítico após a lisogenia pode ocorrer espontaneamente, ou por indução por agentes que causam danos ao DNA.
A proteina repressora cI e um dimero, e cada monomero tem dois dominios globulares, ligados por uma região desestruturada.
A proteina RecA, quando ativada como protease (por indução com ultra violeta por exemplo), quebra os monômeros de cI, que acabam saindo dos operadores, levando à indução de lambda.

O fenômeno de antiterminação foi descoberto com o fago lambda.
Obs: Com o estudo de lambda ficou claro que a RNA polimerase pode interagir com diferentes proteinas de tal forma a fazer antiterminação em diferentes terminadores.
Estudando a antiterminação de lambda verificaram que os sítios determinantes não são exatamente os sítios de antiterminação, são sítios um pouco acima destes.
Sitios de reconhecimento para proteina N são sítios nut (N utilization). nut L entre pL e N. nut R entre fim de cro e tL1.
Várias proteinas se ligando a RNA pol quando passa por sítios nut.
Duas partes no sitio nut, boxA e boxB. Quando passa por boxA proteinas NusB e S10 se ligam a RNApol e depois em boxB, NusA e N se ligam.
Nus vem de N utilization substance.
N se liga a RNA pol somente na presença de NusA. As duas proteinas se ligam entre si in vitro.
N interage com a subunidade beta.
No caso da proteina N tanto terminadores rho dependentes quanto independentes podem ser afetados (pela antiterminação).

Proteina Q e antiterminação:
qut (q utilization), sitio de atuação de Q.